Korean Journal of Cerebrovascular Surgery 2005;7(1):69-74.
Published online March 1, 2005.
Effect of Diazepam on the Expression of Transforming Growth Factor-Beta in Rat Brain Following Transient Cerebral Ischemia.
Shin, Jong Hwan , Kim, Jin Joo , Jung, Tae Gyo , Yang, Hyuk Jun , Kim, Jae Kwang , Lee, Gun , Park, Cheol Wan , Hwang, Sung Youn
1Department of Emergency Medicine, Gil Medical Center, Gachon Medical School, Incheon, Korea. yanghj@gachon.ac.kr
2Department of Neurosurgery, Gil Medical Center, Gachon Medical School, Incheon, Korea.
3Department of Emergency Medicine, Masan Samsung Hospital, Sungkyunkwan University, School of Medicine, Masan, Korea.
Abstract
OBJECT: Transforming growth factor-beta (TGF-beta) is involved in many physiological and pathophysiological processes, such as cell growth, differentiation, inflammation, and tissue repair. It is not yet clear whether the presence of this cytokine has deleterious or protective effects for neurons in a given pathophysiological condition. Several authors have demonstrated that TGF-beta has been shown to rescue cultured neurons from excitotoxic and hypoxic cell death and to reduce infarct size after focal cerebral ischemia in mice and rabbits. The present study investigated the effect of diazepam on the expression of TGF-beta in rat brain tissue after inducing transient cerebral ischemia. METHODS: Ten male rats were killed after a mild and reversible ischemic damage produced by a 15-minutes occlusion of both carotid arteries without occlusion of the vertebral arteries. Five ischemia-treated and 5 sham-operated rats were injected with 10 mg/kg diazepam and vehicle, respectively at 30 minutes, and again 90 minutes following the onset of reperfusion. After 1, 2 and 7 days following the reperfusion, brains were removed from control, sham-operated, and ischemia-treated with or without diazepam-injected groups, then immunohistochemistry and Western blotting for TGF-beta were performed. Cerebral cortices and hippocampi were sectioned from ischemia-treated, shamoperated and control group rats, and stained using cresyl violet. RESULTS: When the immunoblot-results of TGF-beta expression were analyzed using a image analysis system, TGF-beta expression were increased in ischemia-treated without diazepam-injected rats, and decreased in ischemia-treated with diazepam-injected rats at 2 and 7 days after reperfusion compared to control and sham-operated groups. Cresyl violet staining became intense in ischemia-treated without diazepam-injected group and became unclear in ischemia-treated with diazepam-injected group compared to sham-operated and control groups, respectively. CONCLUSION: Diazepam influenced the TGF-beta expression in the brain of ischemia-treated rats.
Key Words: Transforming growth factor-beta, Cerebral ischemia, Diazepam

서     론


  
응급의료체계의 발달로 응급실에서의 전문적 심폐소생술을 받을 때까지 시간이 단축되고 이송 중 처치술이 향상되어 병원 도착 전 심정지 환자에서도 집중적인 소생술 후 치료가 가능한 경우가 많다. 이러한 변화는 소생의학 분야에서 자발적 순환이 회복된 후 영구적인 뇌기능 손상 및 후유증을 막기 위한 뇌 소생술에 대한 활발한 연구와 노력이 요구되고 있다.
   뇌의 허혈성 손상은 허혈의 기간, 정도, 측부 순환로의 상태에 따라 허혈의 위치와 정도가 결정된다. 심정지 환자의 순환 회복 후 발생하는 일시적이고 광범위한 허혈(transient global cerebral ischemia)은 허혈성 저산소증에 민감한 해마체에 있는 피질 제1구역(CA1)의 피라밋 세포와 같은 특정부위의 신경세포를 우선 손상시킨다. 그러나 동일한 혈관지배 하에 있는 서로 다른 부위에서 나타나는 허혈성 저산소증에 대한 민감도의 차이에 관여하는 인자 및 기전은 명확하지 않다.
  
허 혈 후 재관류에 의해 발생되는 이차적인 뇌세포의 손상은 혈관손상, 부종형성, 다형 및 단형백혈구 침착 등과 같은 염증 반응 등이 수 시간에서 수일에 걸쳐 일어나고 부분적인 뇌기능 장애에서 사망을 포함한 다양한 임상 양상을 일으키는 것으로 알려져 있다.2)
   일시적으로 발생한 경미한 허혈은 괴사에 의한 세포사의 과정이 아닌 조절 가능한 세포고사(apoptosis)로 인해 세포사가 진행되는 것으로 알려져 있다. 허혈 후 재관류시 관류 혈액의 증가는 신경세포를 허혈성 손상으로부터 일시적으로 회복시킬 수 있으나 활성 산소 대사물, 유리 지방산, 유리기 등의 생성으로 인한 지연성 뇌세포 손상을 유발하는 세포고사가 p53, fatty acid synthetase(FAS), 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 등의 조절 하에 진행되는 것으로 밝혀졌다.4) 세포고사 과정 이외에 가역적인 허혈손상 과정을 거친 후에 생존한 신경세포에서는 정상적으로 세포의 생존이 불가능한 정도의 장기간 허혈에도 견딜 수 있는 저항력을 유발하는 허혈 사전적응(ischemic preconditioning)이 나타난다.7)
   Gerbil을 이용한 일시적이고 광범위한 뇌허혈 실험에서 디아제팜을 투여하여 해마 CA1의 피라밋 세포의 괴사가 감소되었으며, 이는 디아제팜이 GABA 신경전달을 증강시킴으로서 나타난다고 보고하였다.15) 그러나 이러한 Gerbil에서 디아제팜의 뇌신경세포 보호 효과는 저체온증 효과와 동반될 때 한정된다는 연구와3) 디아제팜에 의한 특정부위 세포의 보호 효과에서 저체온증이 반드시 필요한 사항은 아니라는16) 상반된 연구 결과는 일시적이고 광범위한 허혈실험에서 디아제팜의 뇌신경세포 보호 효과 기전이 아직 명확하지 않음을 의미한다.
   전환성장인자 베타(transforming growth factor-β, TGF-β)는 미세아교세포(microglia), 별아교세포(astrocyte), 신경세포(neuron) 등을 포함한 다양한 기관의 세포에서 세포의 성장, 분화, 염증, 조직의 치유 등 다양한 생화학적 작용에 관여하는 사이토카인이다. TGF-β는 불활성화 형태로 분비되어 산성화, 알칼리화, 열, 단백분해효소 등에 의해 활성화된다. 한편 TGF-β는 정상적인 뇌에는 극소량이 미세하게 분포되어 있으며 외상, 독성 자극, 허혈 및 저산소증 등에서 그 발현이 증가하지만8) 병태생리학적으로 신경세포에 작용하는 역할은 최근에 이르기까지 명확히 밝혀지지 않은 사이토카인이다.
   독성 자극 및 저산소증으로 인한 세포 괴사에서 TGF-β가 신경세포의 괴사 과정을 억제하는 보호 효과와,12) 부분적 뇌허혈로부터 TGF-β가 뇌경색의 크기를 줄였다는 연구 결과,5) 그리고 저산소증 및 허혈이 유발된 쥐의 신경세포 손상을 개선시켰다는 보고가 있다.11) 이러한 TGF-β의 외부 자극에 대한 뇌신경세포 보호 기능을 시사하는 연구 결과와는 반대로 TGF-β가 인간 면역결핍 바이러스에 의한 뇌병증과 알츠하이머병에서는 뇌의 퇴행에 기여한다는 연구도 보고 되었다.17)18)
   본 연구는 뇌허혈만 유발한 백서와 뇌허혈 유발 후 디아제팜을 투여한 백서에서 TGF-β의 발현 차이를 확인하고, 뇌허혈 후 디아제팜으로 치료한 백서의 뇌에서 디아제팜과 TGF-β의 뇌세포 보호 기능의 상호 관련성를 조사하고자 하였다.

대상 및 방법

   연령이 12
~15주이고 몸무게가 130~150 gm인 Fisher344 백서를 사용하였으며 마취는 ketamine을 사용하였다. 정상군, sham군, 뇌허혈 유발 후 디아제팜을 사용하지 않은 군과 디아제팜을 사용한 군으로 분류하여 각 군마다 5마리 씩 총 20마리를 실험 대상으로 하였다.
   각 군에서 1, 2, 7일 후에 뇌를 적출한 뒤 대뇌피질 및 해마부위를 절편하고 monoclonal antiTGF-β antibody를 사용하여 free-floating method로 면역조직화학 염색을 시행하였으며, 또한 동일 항체를 이용한 Western Blotting을 시행하여 해마 부위에서의 TGF-β의 발현을 확인 하였다.

1. 실험동물 사육 환경
  
식품의약품안전청에서 생산한 Fisher344 수컷 백서를 사용하였으며 실험 기간 중의 사육환경은 온도 23±2℃, 습도 50±20%, 일당 12시간 조명으로 맞추어 주었다. 펠렛 사료와 물은 자유로이 취할 수 있도록 하였으며, 실험 시 백서의 평균 몸무게는 140±10 gm이 되도록 하였다. 

2. 실험동물 준비
  
마취 10분전에 황산 아트로핀 0.01 mg/100 gm을 피하 주사하였고, 마취는 ketamine hydrochloride를 6.25 mg/100 gm의 용량으로 복강 내로 투여하여 유도하였다. 

3. 뇌허혈 손상 유발
   10마리의 뇌허혈유발 군에서 뇌허혈은 경부 전면을 소독하고 털을 제거한 후 약 2 cm의 정중경부 절개를 통해 흉유양돌기근을 외측으로 전위하여 양쪽 총경동맥을 노출하고 미주신경을 분리한 후 동맥류 클립(aneurysm clip)으로 양쪽 총경동맥을 동시에 15분간 결찰 하였다. 15분 후 양쪽 총경동맥의 클립을 제거하여 육안으로 혈행을 확인하고 절개부위 봉합과 소독을 시행하였다.

4. 디아제팜 투여
   5마리의 허혈 유발군에서 15분간의 양쪽 총경동맥 결찰 후 재관류를 시행한 다음 30분과 90분 후에 디아제팜 1 mg/ 100 gm을 복강 내에 투여하였다. 

5. 단백질 정량(Protein assay)
   총 20마리의 백서에서 정해진 시간 별로 뇌를 적출하여 해마 부위만을 취하였다. 해마는 인산염완충액(Phosphate Buffer Solution, PBS)으로 두 번 씻어준 후 1 ml의 cold lysis buffer(10×PBS 10 ml에 1 ml의 Triton X-100, 0.5 gm sodium deoxysholate, 0.1 gm sodium dodecylsulfate, 그리고 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride를 넣어 탈이온수로 100 ml를 만들어 용해시켰다. 이후 12000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리를 시행하여 상층액을 취하고 표준 단백질 시료(595 nm)를 준비하여 알부민(2 mg/ml)에 녹였다. H2O2 100 μl에 준비된 단백시료를 10 μl 첨가하여 11배로 희석하였다. 표준시료 및 단백시료에 10 μl당 평가시약(Bradford, Bio Rad) 100 μl를 첨가하였다. 평가시약은 사용 직전에 1:5로 희석하여 Whatman 여과지(Whatman No. 1, Bio Rad)로 여과하여 사용하였다. 상온에서 10분 정도 기다리고 모든 시료는 시약 첨가 후 흡광도를 측정하였다. 표준시료 중 최종 농도가 0 μg/ml인 것을 읽어주고 표준시료를 편광분석기로 읽어 표준곡선(standard curve)을 그리고 각 단백시료를 읽었다. 평광분석기로 읽은 흡광도나 농도 희석 비율에 따라 환산하였다.

6. 전기영동(Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)
   각 실험 군으로부터 50 μg의 단백질을 sampling buffer (200 mM Tris-HCl:pH 6.8, 4% SDS, 10% glycerol, 10% β-mercaptoethanol, bromophenol blue)와 혼합하여 2분간 중탕한 뒤 SDS-PAGE(10% separating gel, 5% stacking gel)를 이용하여 100볼트에서 약 3시간 동안 전기영동을 실시하였다.

7. Western blotting
  
Enterochromaffin-like(ECL) kit는 nucleocapsid membrane에 젤을 옮긴 다음 공기 중에서 말린 후 1시간 동안 2% skin milk와 PBS-Tween(PBST) 20(0.1%)에서 헹궜다. PBST에서 두 번 린스한 후 10분 동안 2회에 걸쳐 세척하였다. 다음에 1차 항체를 부착하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. PBST에서 린스와 세척을 반복하고 2차 항체를 부착하고 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG(1:2,000 dilution) 린스와 세척을 하였다. ECL detection과정은 막을 침수하기 바로 직전에 동일 양의 두 가지 용액을 혼합하고 표면 장력을 이용하여 막 위에 부착한 뒤 1분 동안 배양하였다. 이후 Saran wrap으로 젤을 감싸고 시간 간격을 두고 방사선 필름에 노출시켰다.

8. Cresyl violet(Vogts) method
   총 20마리의 백서에서 정해진 시간에 따라 백서의 뇌를 적출한 후 파라핀 블록을 만들었다. 검체는 4 μm로 절편 하였고 10% buffer neutral formalin으로 고정하였다. Cresyl echt violet(0.12 gm)을 증류수(120 ml)에 용해하고 glacial acetic acid(0.2 ml)를 가해 60℃에서 2시간 가온하고 여과하여 사용하였다. Acetic acid-alcohol 용액은 95℃ ethanol(99.7 ml)과 glacial acetic acid(0.3ml)로 만들고 탈파라핀은 함수 70%, 80%, 90%, 95%, 95%, 100%, 100% alco-hol로 시행하였다. 흐르는 물에 약 15
~20회 수세하고 니슬 염색액을 10초 동안 조직에 투여하고 70% ethanol과 acetic acid-alcohol 용액에 2회 담구었다. 이후 95%와 100% ethanol에 탈수하고 xylene I, II, III에 30회 씩 담구기를 반복하였다.

9. 통계 분석
   SPSS 11.5를 이용하여 각 군에서 TGF-β의 발현 정도는 Mann-Whitney test로 분석하였고 통계자료는 평균±표준편차로 표시하였다. 유의수준은 p<0.05 인 경우 유의한 것으로 판정하였다.

결     과

1. Western blotting에 의한 TGF-β 발현
  
일시적 뇌허혈 및 재관류 후 백서의 해마 조직에서 TGF-β의 발현을 Western blotting과 정량적인 영상 분석법에 의해 디아제팜을 투여하지 않은 백서와 투여한 백서에 대해 각각 1일, 2일, 7일째에 TGF-β 발현을 비교하였더니 해마 조직에서는 디아제팜을 투여하지 않은 백서가 각각 5.9±1.2, 9.2±2.1, 22.8±1.9(% volume)이었고 디아제팜을 투여한 백서는 12.1±1.4, 6.1±0.9, 3.5±1.1(% volume)로 디아제팜을 투여하지 않은 백서에 비해 디아제팜을 투여한 백서에서 2일째부터 TGF-β의 발현이 통계적으로 유의하게 감소하여(p<0.05) 7일째에는 현저한 차이를 나타내었다(p<0.005)(Fig. 1).

2. 해마에서 면역조직화학적 염색에 의한 TGF-β의 발현
  
대조군, sham-operated 군, 일시적 뇌허혈 및 재관류군에서 2, 7일째에 백서의 해마를 면역조직화학적 염색을 하여 비교한 결과, TGF-β의 발현은 디아제팜을 투여하지 않은 군보다 디아제팜을 투여한 군에서 대조군 및 sham-operated 군에 비해 현저히 감소한 소견을 보였다(Fig. 2).

3. 대뇌피질에서 면역조직화학적 염색에 의한 TGF-β의 발현
  
대조군, sham-operated 군, 일시적 대뇌허혈 및 재관류군에서 2, 7일째에 백서의 대뇌피질을 면역조직화학적 염색을 하여 비교한 결과, TGF-β의 발현은 디아제팜을 투여하지 않은 군보다 디아제팜을 투여한 군에서 대조군 및 sham-operated 군에 비해 현저히 감소한 소견을 보였다(Fig. 3).

고     찰

   백서의 중대뇌동맥을 결찰하여 비가역적인 국소적 허혈을 유발한 연구에서 허혈 유발 2일째에 TGF-β의 messenger ribonucleic acid(mRNA)가 대뇌피질에서 가장 높게 상승되었고 상승된 TGF-β의 mRNA는 15일간 지속적으로 높게 유지되었다. 다른 사이토카인인 TNF-α, 인터루킨(interleukin, IL)-1 β, IL-6의 mRNA의 발현이 12시간에 최고에 이르렀다가 5일 째에 정상농도에 도달하는 것과는 달리 TGF-β는 이들보다 상대적으로 늦게 상승하고 장시간 상승된 농도를 유지하는데 이러한 TGF-β의 mRNA 발현 양상은 허혈이 유발된 대뇌피질에서 단핵구와 대식세포의 축척 과정과 동일한 양상으로 진행하며 국소 허혈이 이루어진 뇌의 세포외 기질에서 발현이 증가하므로 TGF-β가 허혈성 뇌손상에서 항염증 과정과 조직의 재형성 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고 되었다.19) 
   문헌에 의하면 허혈성 뇌세포의 손상기전 중에서 뇌세포의 글루탐산염 수용체의 과도한 활성화가 중요한 역할을 한다고 알려져 있고, 이와 같은 글루탐산염의 뇌독성은 유리기들의 발생으로 설명되어지며 유리기와 산화질소(NO)의 반응은 Ca 이온 의존성을 띠는데 이때 TGF-β를 투여하면 이 단계를 막아서 뇌세포 보호 효과를 가져온다고 하였다.6)9)
   또 최근에는 가역적인 일시적 뇌허혈에서 뇌세포의 지연사를 세포고사의 기전으로 해석하려는 많은 연구가 진행 중이며 전반적인 뇌허혈 연구에서 허혈에 취약한 뇌 부위에서 세포고사를 반영하는 deoxyribonucleic acid(DNA) 분절 및 DNA의 형태학적 변화가 관찰되었고,10) TGF-β가 세포고사로부터 뇌세포를 보호하는 기전을 백서의 해마에서 뇌보호 단백질로 알려진 Bcl-2 단백질의 발현 증가로 설명하는 견해도 있다.13)
   비가역적인 허혈에서 TGF-β의 발현이 15일간 지속적으로 높게 유지된 것과19) 마찬가지로 15분 결찰 후 재관류를 시행하여 경미하고 가역적인 일시적 뇌허혈을 유발한 저자들의 실험에서도 허혈 1일째보다 2, 7일째 TGF-β의 발현이 증가하여 유사한 결과를 얻게 되었다. 
   백 서에 가역적인 뇌 부분적 허혈을 일으킨 뒤 TGF-β에 선택적인 길항제를 투여하였더니 경색된 부위가 대조군 보다 3.5배 증가 하였다고 보고하여 TGF-β가 뇌세포 손상을 억제하는 신체 방어 사이토카인이란 것을 간접적으로 증명하기도 하였지만14) 다른 문헌에서는 백서에 가역적인 광범위한 뇌허혈 유발 후 TGF-β를 뇌실에 각기 다른 농도로 투여하고 뇌세포 보호 역할을 확인한 결과 높은 농도를 투여한 군에서 오히려 뇌세포 보호 효과가 적은 것으로 나타나 TGF-β의 뇌세포 보호 역할에 대해서는 아직 논란의 여지가 있다고 보고하였다.7)
   중대뇌동맥을 결찰한 가역적 뇌허혈 실험으로 TGF-β의 발현부위를 확인한 결과에서 TGF-β mRNA의 발현은 새피질(neocortical)의 반음영(penumbra) 부위의 미세아교세포와 대식세포에서만 발현이 확연히 증가한다고 하였고9) 원숭이를 이용한 뇌허혈 연구에서도 뇌경색이 확인된 주변의 반음영 지역에서 TGF-β 발현이 현저하다는 것을 관찰하였다.1)
   디아제팜의 뇌허혈 후에 나타나는 뇌세포 보호 효과는 GABA의 신경전달을 증강시켜서 허혈 후에 발생하는 지연성 뇌손상의 활성화를 억제하는 기전과 디아제팜 투여 후 동반되어 발생하는 경도의 저체온증 효과로 인한 기전의 상승작용에 의한 것으로 설명되고 있다.15)
   저자들의 실험에서는 일시적 뇌허혈 후 디아제팜을 투여한 군에서 TGF-β의 발현이 대조군, sham-operated 군, 디아제팜을 투여하지 않은 군에 비해 현저히 감소된 것으로 분석되었으나 디아제팜 자체가 TGF-β의 발현을 직접적으로 억제한 것인지, 아니면 디아제팜의 GABA 신경전달 증강과 저체온증 유발 효과에 의한 뇌세포 보호 기전으로 TGF-β의 발현이 감소된 것인지는 구분될 수 없었던 것이 본 연구의 제한점이라고 생각된다.
   향후 뇌허혈 후 뇌세포에 작용하는 디아제팜의 기전을 더욱 명확히 하기 위해서는 디아제팜이 TGF-β를 직접적으로 억제하는지의 여부와, 뇌허혈 후 디아제팜을 투여함과 동시에 TGF-β를 인위적으로 투여하는 군과 투여하지 않은 군을 비교하여 뇌세포 손상을 줄이는 정도를 관찰하는 실험을 시행하는 것이 필요하리라 생각된다.

결     론

   일시적 뇌허혈 후 디아제팜이 투여된 백서의 대뇌피질과 해마에서 TGF-β의 발현이 감소되어 있어 디아제팜이 TGF-β의 발현에 영향을 주었음을 알 수 있었다. 


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