Korean Journal of Cerebrovascular Surgery 2005;7(4):317-323.
Published online December 1, 2005.
Changes in HSP 70 Distribution to Diazepam After Transient Global Ischemia in Rat.
Kang, Young Joon , Kim, Jin Joo , Kim, Jae Kwang , Lim, Yong Su , Yang, Hyuk Jun , Park, Cheol Wan , Lee, Gun
1Department of Emergency Medicine, Gil Medical Center, Gachon Medical School, Incheon, Korea. yanghj@gachon.ac.kr
2Department of Neurosurgery, Gil Medical Center, Gachon Medical School, Incheon, Korea.
Abstract
PURPOSE
Cerebral ischemia leads to neuronal damage in specific area of the brain of both rodents and humans. After ischemia, the pyramidal cells in area CA1 of the hippocampus are particularly sensitive but death of these pyramidal cells in delayed at least 3-4 days after a transient cerebral ischemia. Induction of Heat shock proteins 70 (HSP70) has been mainly observed in resistant area, and thus a protective effect of HSP70 has been proposed. The presence of HSP70 is a good indicator of the general pathophysiologic stress response to ischemia, but not necessarily a marker for neuronal survival. The present study investigated the change of HSP70 in ischemic and diazepam treated ischemic rat, and evaluated the distribution of HSP70 in the rat brain. METHODS: Fisher344 rats were used in the present experiments. Mild transient ischemia was induced by two-common carotid artery occlusion and reperfusion. Ischemia-treated and sham-operated rats were injected i.p. with 10 mg/kg diazepam or vehicle at 30 minutes, and again 90 minutes following the onset of reperfusion. After 1, 2 and 7 days following the reperfusion, brains were removed and immunohistochemistry and Western blotting for HSP70 were performed. For immunostaining, brain tissues were prepared following intracranial perfusion and frozen sections cut on a cryostat. Sections were incubated with a mouse monoclonal antibody by free-float method. Hippocampal tissues at the indicated time were prepared for Western Blot analysis. For the determination of protein levels of HSP70, tissue extracts were subjected to ECL Western Blot analysis using primary antibody. The result from Western Blotting was expressed numerically through the image analysis. RESULTS: HSP70 expression is markedly increased in 2 day groups of mild transient cerebral ischemia after reperfusion. HSP70-positive cells were observed in the cerebral cortex, striata terminalis, hippocampus after 2 days following the onset of ischemia. HSP70 expression increased in ischemic damaged rat brain at 1 day after reperfusion and immunostaining became particularly intense in the cerebral cortex and hippocampus. At 7 days HSP70 expression were increased in ischemic rat and decreased in the diazepam treated rat brain. In preconditioning ischemia, there is no ischemic cell death due to necrosis and apoptosis. CONCLUSION: HSP 70 expression increased in diazepam-treated group after 2 days following the onset of the ischemia. But, after 7 days following the onset of the ischemia, HSP 70 expression of diazepam-treated group decrease more than diazepam-untreated group. In the morphologic findings, HSP 70-positive cells were observed in the cerebral cortex (S1 cortex, insular cortex, auditory cortex, visual cortex), stria terminalis, hippocampus (CA1 And CA3 region) after 2days following the onset of ischemia.
Key Words: HSP 70, Cerebral Ischemia, Diazepam

서     론


  
미국의 경우 저산소성이나 허혈성 뇌손상이 주요 사망원인으로 년 간 약 50 만명 정도가 저산소성이나 허혈성 뇌손상에 노출되며 그중 약 30%가 사망하고 70%는 심각하고도 영구적인 장애를 일으키는 것으로 알려져 있다. 저산소성 상황은 뇌혈류의 감소뿐만 아니라 익수, 일산화탄소 중독, 저혈당 등에서도 발생하는데 뇌의 각 조직은 서로 다른 감수성을 가지고 세포 손상의 변화가 일어난다.
   허혈성 뇌손상에 효과적인 치료를 시도하기 위해서는 뇌손상의 방어에 관여하는 물질을 명확히 규명할 필요가 있다. 뇌보호 기전과 연관되어 최근에 활발히 연구가 진행되는 유전자로 Rordorf 등17)은 허혈에 대해 가역적인 손상을 입은 신경세포에서 발현되는 c-Fos, c-Jun과 같은 초기유도 유전자와 경색 주위에 반음영(penumbra)이라는 변성된 단백질이 다량 존재하는 가역적 손상 부위뿐만 아니라 비가역적 손상 부위에서도 열충격인자(heat shock factors, HSFs)를 통해 발현되는 HSP70(heat shock protein 70)이라고 하였다. 일시적 뇌 허혈 유발 후 재차 뇌 허혈에 노출 시 허혈 손상에 견디는 능력이 증가되는데 HSP70의 발현이 동반되는 것으로 밝혀졌고 이미 실험실 수준에서는 대표적인 뇌손상 기전인 글루타메이트(glutamate) 독성에 HSP70의 신경보호 효과가 Rordorf 등17)의 실험에서 알려졌다.
   본 연구에서는 HSP70의 뇌조직에서의 분포 양상을 관찰하여 허혈-재관류에 의한 뇌손상에서 세포의 취약성을 측정하고 나아가서 신경보호 효과가 있는 물질의 치료효과 확인에 HSP70을 적용하고자 한다.

대상과 방법

   연령이 12
~15주이고 몸무게가 130~150 gm인 Fisher344 백서를 사용하였으며 마취는 케타민을 사용하였다. 정상군, Sham군, 디아제팜을 사용하지 않은 군, 디아제팜을 사용한 군 으로 분류하여 각각 5마리 씩을 대상으로 하였다.
   허혈 유발군은 1, 2, 7일 후에 뇌를 적출한 뒤 antimouse anti-HSP70를 사용하여 free-floating method로 면역조직화학 염색을 시행하였으며, 또한 동일 항체를 이용한 Western Blotting을 시행하여 해마 부위에서의 HSP70의 발현을 확인 하였다.

1. 실험동물 사육 환경
  
식품의약품안전청에서 생산한 Fisher344 수컷 백서를 사용하였으며 실험 기간 중의 사육환경은 온도 23±2℃, 습도 50±20%, 12시간 조명으로 맞추어 주었다. 펠렛 사료와 물은 자유로이 취할 수 있도록 하였으며, 실험시 백서의 평균무게는 140±10 gm가 되도록 하였다.

2. 실험동물 준비
  
마취 10분전에 황산 아트로핀을 0.01 mg/100 gm로 피하 주사하였다. 마취약은 케타민을 사용하였다.

3. 뇌허혈 손상 유발
  
허혈은 절개부위의 소독과 털의 제거 후 약 2 cm의 정중경부 절개를 통해 흉유양돌기근에서 양쪽 총경동맥을 노출하여 미주신경을 분리하고 동맥류 클립(aneurismal clip)으로 동시에 양쪽 총경동맥을 15분간 결찰하였다. 15분 후 양쪽 총경동맥의 클립을 제거하여 육안으로 혈행을 확인하고 봉합과 소독을 시행하였다.

4. 디아제팜 투여
   15분의 양쪽 총경동맥 결찰 후 재관류를 시행한 다음 30분과 90분에 디아제팜 1 mg/100 gm을 복강 내에 투여하였다.

5. 단백질 정량(protein assay)
   정해진 시간 별로 백서의 뇌를 적출하여 해마 부위만을 취하였다. 해마는 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 두 번 씻어준 후 1 ml의 cold lysis buffer(10×PBS 10 ml에 1 ml의 Triton X-100, 0.5 g sodium deoxysholate, 0.1 g SDS, 그리고 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 넣어 탈이온수로 100 ml을 만들어줌)로 용해시켰다. 이후 12000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리를 시행하여 상층액을 취하고 표준 단백질 시료를 준비하여 알부민(albumin:2 mg/ml)에 녹인다. H2O2 100 μl에 준비된 단백시료를 10 μl 첨가하여 11배로 희석한다. 표준시료 및 단백시료에 10 ul 당 평가시약(Bradford, Bio Rad) 100 ul 첨가한다. Bradford 시약(Bio Rad)는 사용 직전에 1:5로 희석하여 Whatman 여과지(Whatman No. 1, Bio Rad)로 여과하여 사용하였다. 상온에서 10분 정도 기다리고 모든 시료는 시약 첨가 후 흡광도를 측정한다. 표준시료 중 최종 농도가 0 μg/ml인 것을 읽어주고 표준시료를 편광분석기로 읽어 표준곡선(standard curve)을 그리고 각 단백시료를 읽는다. 편광분석기로 읽은 흡광도나 농도 희석 비율에 따라 환산하였다.

6. 전기영동(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelphoresis, SDS-PAGE)
   각 실험 군으로부터 50 μg의 단백질을 sampling buffer (200 mM Tris-HCl:pH 6.8, 4% SDS, 10% glycerol, 10% β-mercaptoethanol, bromophenol blue)와 혼합하여 2분간 중탕한 뒤 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE;10% separating gel, 5% stacking gel)를 이용하여 100 Volt에서 약 3시간 동안 전기영동을 실시하였다.

7. Western blotting
  
Enterochromaffin-like(ECL) kit는 NC(nucleocapsid) membrane에 젤을 옮긴 다음 공기 중에서 말린 후 1 시간 동안 2% skin milk와 PBS-Tween(PBST) 20(0.1%)에서 헹군다. PBST에서 두 번 린스한 후 10분 동안 2회 걸쳐 세척한다. 다음에 1차 항체를 부착하고 1시간 동안 실온에서 배양한다. PBST에서 린스와 세척을 반복하고 2차 항체를 부착하고 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG(1:2,000 dilution)린스와 세척을 한다. ECL Detection 과정은 막을 침수하기 바로 직전에 동일 양의 두 가지 용액을 혼합하고 표면 장력을 이용하여 막 위에 부착한 뒤 1분 동안 배양한다. 이후 Saran wrap으로 젤을 감싸고 시간 간격을 두고 X-ray 필름에 노출시킨다.

8. Cresyl violet staining method
   정해진 시간에 따라 백서의 뇌를 적출한 후 파라핀 블록을 만들었다. 검체는 4 um으로 절편 하였고 10% buffer neutral formalin으로 고정하였다. Cresyl violet(0.12 gm)을 증류수(120.0 ml)에 용해하고 glacial acetic acid(0.2 ml)를 가해 60℃에서 2시간 가온하고 여과하여 사용한다. Acetic acid-alcohol solution은 95℃ ethanol(99.7 ml)와 glacial acetic acid(0.3 ml)로 구성하고 탈파라핀은 함수 70%, 80%, 90%, 95%, 95%, 100%, 100% alcohol로 시행한다. 흐르는 물에 약 15
~20회 수세하고 니슬 염색액을 10초 동안 조직에 투여하고 70% ethanol과 acetic acid-alcohol 용액으로 2회 담근다. 이후 95%와 100% ethanol에 탈수하고 xylene I, II, III을 30회씩 담그기를 반복하였다.

9. 통계 분석
   SPSS 11.5를 이용하여 각 군에서 HSP70의 발현 정도는 Mann-Whitney test로 통계 분석하였고 CA 영역에서 생존한 신경세포의 개체에 대한 비교는 Kruscal-Wallis test로 통계 분석하였으며 통계자료는 평균±표준편차로 표시하였다. 유의수준은 p<0.05인 경우 유의한 것으로 판정하였다.

결     과

1. 경미한 일시적 전뇌허혈 재관류 백서 모델의 신경세포 허혈 사전적응
   15분간 총경동맥 결찰에 의한 백서의 일시적 전뇌허혈 재관류 모델에서 이와 같은 허혈 사전적응을 시행 하였을 때 2, 7일째 HSP70의 발현이 뚜렷하였으며 1, 2, 7일째 각각 백서의 뇌적출 후 CA1, CA2, CA3 영역에서 생존한 신경세포의 개체 수를 Sham 군과 허혈군과 Diazepam 투여군을 비교하였더니 허혈군과 Diazepam 투여군에서 생존 신경세포의 개체수가 유의하게 감소 되어있지 않았고(p>0.05)(Fig. 1) 일시적 전뇌허혈 재관류 7일째 시행한 Cresyl violet 염색 상에서 뚜렷한 신경세포사도 관찰되지 않았다(Fig. 2).

2. Western Blotting에 의한 HSP70 발현
  
일시적 전뇌허혈 재관류후 백서의 해마 조직과 해마외 뇌조직에서의 HSP70의 발현을 Western Blotting과 정량적인 영상 분석법에 의해 Sham 군과 허혈군에 대해 각각 1일, 2일, 7일째에 HSP70 발현을 비교하였더니 해마 조직에서는 Sham 군이 각각 3.9±1.2, 16.3±2.3, 2.1±1.1이었고 허혈군은 4.4±1.2, 9.8±2.4, 14.7±2.4로 나타났다. 또한 Diazepam 투여군은 9.9±3.1, 33.7±2.7, 5.1±1.3으로 허혈군에 비해 2일째에는 HSP70의 발현이 급증하였다가 7일째에 유의하게 감소하였으며(p<0.05)(Fig. 3) 해마외 뇌조직에서는 각 1일, 2일, 7일째에 HSP70 발현이 Sham 군에서 각각 2.3±0.8, 8.1±1.5, 6.1±1.5이었고 허혈군은 17.6±3.2, 20.1±3.7, 7.2±1.2으로 Sham군에 비해 허혈군에서 1일째부터 HSP70의 발현이 급증하여 2일째 최고치를 보여 유의한 차이를 나타냈고(p<0.05) Diazepam 투여군은 1.8±0.5, 6.9±1.2, 2.7±1.5로 나타나 Diazepam 투여군은 허혈군에 비해 1일째, 2일째, 7일째에 각각 현저한 감소를 타나내어 통계적인 유의한 차이가 있었다(p<0.001)(Fig. 4).

3. 면역조직화학적 염색에 의한 HSP70 발현
  
면역조직화학적 염색을 통해 일시적 전뇌허혈 재관류 후 2일째 백서의 뇌조직에서 HSP70 양성세포는 뇌피질(visual cortex, auditory cortex, insular cortex), 분계선조(striata terminalis), 해마(CA1, CA2, CA3) 부위에서 관찰되었고 특히 해마의 CA1 영역에서 가장 현저한 발현을 나타내 보였다(Fig. 5). 반면 Sham 군에서의 HSP70의 발현은 미약하거나 CA2 영역에서는 전혀 발현되지 않았다.

고     찰

   뇌의 허혈성 손상에서 일정한 뇌영역에 혈액을 공급하는 동맥의 폐색, 뇌출혈, 외상에 의해 발생하는 국소적(focal cerebral ischemia)허혈은 허혈의 기간, 정도, 측부 순환로의 이용에 따라 허혈의 위치와 정도가 결정된다. 심정지 및 소생에 의해 발생하는 일시적 전뇌허혈(transient global cerebral ischemia)은 뇌전반에 일시적인 혈행 장애를 유발하며 허혈성 저산소증에 민감한 특정부위의 신경세포의 손상을 유발한다. 동일한 혈관지배에 있는 부위에서 이러한 허혈성 저산소증에 대한 민감도에 차이가 있는 것은 어떠한 내부인자가 관여하는 것이 아닌가 생각된다. 전반적이거나 국소적인 뇌 허혈은 수 시간에서 수 일에 걸쳐 특징적인 뇌손상을 일으키는데 허혈성 뇌손상에서 감수성이 높은 지역으로 대뇌피질의 피라미드 신경원, 소뇌의 purkinje 세포, 해마 CA1, amygdala, 선조, 간뇌 등인 것으로 알려져 있다. 해마의 CA1 지역인 경우 전반적 뇌허혈 후 약 2일 후부터 손상이 관찰되고 중뇌동맥 폐색과 같은 중증의 국소적 뇌허혈은 1일 이내에 뇌세포 손상이 Carcia 등5)의 연구에서 관찰되었다.
   허혈에 의한 뇌손상에 관여하는 물질로써 Choi 등6)9)은 1) 칼슘, 포타슘, 나트륨의 상승에 따른 이온 항상성의 파괴 2) 자유지방산(free fatty acid:FFA), 일산화탄소(CO), 글루타메이트(glutamate), 지질화 산화물(lipid peroxidase)와 같은 지질유래산물 3) 흥분신경전달 물질의 과다방출 등 매우 다양한 물질 등이 관여하여 효소 소화(enzyme digestion)와 단백질 변성을 통해 뇌세포 손상이 일어나는 것을 주장하였다. 저산소증과 허혈-재관류에 의해 발생되는 이차적인 뇌세포 손상은 결국 혈관손상. 부종형성, 다형·단형백혈구 침착 등과 같은 염증 반응이 수 시간에서 수일에 걸쳐 일어나며 부분적인 뇌기능 장애에서 사망 등 다양한 임상증상으로 나타난다고 Barone 등2)9)은 발표하였다. 짧은 기간 경도의 허혈은 괴사(necrosis)에 의한 세포사의 과정이 아닌 조절 가능한 세포자멸사(apoptosis)로 세포사가 진행되는 것으로 알려져 있다. 허혈-재관류시 관류 혈액의 증가는 조직을 허혈성 손상으로부터 회복시킬 수 있으나 재관류 기간에 관류액의 증가는 활성 산소 대사물의 생성, 유리된 지방산, 유리기 등의 생성과 연관되어 지연성 뇌세포 손상의 형태로 p53, 지방산 합성효소(fatty acid synthetase, Fas), 종양괴사인자(Tumor necrosis factor, TNF) 등의 유전자가 관여하는 조절 가능한 세포죽음의 과정인 세포자멸사가 Fraser 등12)의 실험에서 밝혀졌고 짧은 기간 경도의 허혈이 세포고사 과정 이외에 가역적인 손상의 결과로 세포가 생존하거나 재생되는 경우가 발생할 수 있는데 이 경우 정상적으로 세포의 생존이 불가능한 정도의 긴 허혈에도 견딜 수 있는 저항력을 유발하는 허혈 사전적응(ischemic preconditioning)이 나타난다. 결국 뇌손상 방어기전의 연구는 조절 가능한 세포자멸사와 허혈 사전적응에 관여하는 유전자를 밝히는데 초점을 두고 활발히 논의되고 있다.
   다형백혈구의 활성과 침착을 억제하는 물질의 동물실험에서 뇌 보호 효과가 Jiang 등14)의 실험에서 입증되고 신경보호 효과가 있는 물질로 억제성인 GABA의 기능을 향상시키는 물질인 스테로이드, 마그네슘, 저체온법 등이 Barone과 Feuerstein3)에 의해 알려져 있는데 신경세포의 수적 감소 및 행동장애의 관찰로 그 효과를 입증하였다. 뇌손상의 방어에 관여하는 물질과 허혈성 뇌손상에 의한 뇌세포 손상에서 다양한 유전자의 활성변화 및 단백질 생성의 변화가 유도되는 것으로 알려졌는데 이러한 특정부위에 발현되는 유전자를 통해 뇌세포 방어기전을 담당하는 유전자를 규명하고 있다.
   An 등1)20)의 연구에 의하면 뇌허혈 후 발현이 증가되는 유전자로 초기유도 유전자(immediate early genes:IEGs), Heat shock proteins, 신경 성장 인자(nerve growth factor), 인슐린유사 성장 인자(insulin-like growth factor)ⅠⅡ, 엔케팔린(enkephalin)이 있고, 감소하는 유전자로는 뉴트로핀(Neutropin)3, GABA A receptor 등이 있다. 그 외 항산화 관련효소, 미토콘드리아 투과억제, 유전자 발현이 뇌세포 보호기능과 연관되어 활발히 연구가 진행되고 있다. HSP70은 염색체 1, 5, 6, 14, 21 등에 유전적 정보를 가지고 있으며 HSP70, HSP72, HSP73, 당조절 단백질(glucose regulated protein, GRP)78 등 발현위치 및 기능에 따라 분류된다. 뇌 허혈은 이와 같은 수많은 유전자의 발현에 변조기의 역할을 하며 이때 변화된 유전자의 일부는 내인성 뇌보호 기능과 손상된 세포의 복원에 중요한 역할을 담당하리라 생각되지만 일부는 세포고사와 같은 허혈 세포의 사망에 관여하는 것이 아닌가 생각된다. 진핵세포 동물에서 관찰되는 HSP으로 28, 70, 84, 90, 95, 110 kDa이 관찰되었고 이후 60, 40 kDa가 추가로 확인되었다. Criag 등10) 및 Welch 등24)의 연구에서 HSP70은 ATP 의존성 대사를 통해 변성된 단백질의 변성을 억제하고 재생하는 허혈에 대항한 자가 방어 기전으로써의 분자적 샤프론(chaperone)의 역할을 한다고 하며 그 밖에도 HSP110이 그와 같은 역할을 한다고 보고 하였다. HSP110 계에 속하는 허혈 반응 단백(ischemia responsive protein, irp)94는 뇌 허혈 유발시 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다.
   HSP70은 72,000 mol의 질량을 가지고 있으며 HSP72, 73, GRP75, 78 등이 이 단백질 군에 속하며 대부분의 생물체에서 발견되는 스트레스 저항 단백질로써 허혈, 열, 저혈당, 바이러스감염, 경련, 중금속 오염 등 다양한 형태의 스트레스 상황에서 농도가 증가하는 것으로 Gonzalez 등4)13)22)의 연구에서 알려져 있으며 세포내의 변성된 단백질은 열성단백질 인자를 자극하여 HSP70유전자의 전사를 유도하여 HSP70을 생성한다. HSP70은 원핵과 진핵세포의 세포질에서 생성되어 핵과 세포질에서 모두 분포하며 다양한 스트레스 상황에서는 그 위치가 세포질에서 핵, 특히 핵소체에 축적된다고 Velazquez 등23)의 연구에서 주장하였다. 일시적 뇌 허혈 유발후 재차 뇌 허혈에 노출시 허혈 손상에 견디는 능력이 증가되는데 HSP70의 발현이 동반되는 것으로 밝혀졌고 이미 실험실 수준에서는 대표적인 뇌손상 기전인 글루타메이트(glutamate)독성에 HSP70의 신경보호 효과가 Rordorf 등17)의 실험에서 알려졌다. 그러나 HSP70의 뇌보호 효과는 비가역적인 손상 부위에서도 증가된다는 것이 보호 기전을 설명하는데 제한점이라고 Chen 등7)8)의 실험에서 제기되기도 하지만 HSP70에 대한 연구는 세포 상해에 저항이 있는 지역에서 주로 발견되어 HSP70의 방어 기전으로서의 역할에 대한 연구로 진행되며 최근에는 HSP70의 존재가 허혈에 대한 일반적인 병태생리학적 자극반응의 정도기준에 적용하는 연구가 진행되고 있다.
   뇌허혈 후 내인성 보호기전을 찾는데 즉각 초기 유전자인 HSP는 허혈 유발 후 비슷한 시기에 발현되며 초기 유도 유전자는 허혈시 다양한 부위의 중추신경계에서 재관류 1시간 이내에 발현되며 그 기전은 글루타메이트의 분비, 세포내 칼슘농도의 증가가 cAMP 등을 자극하여 유전자 발현을 유도하는데 이미 구조와 역할이 밝혀진 것으로 유전자로 c-Fos, fos-B, c-Jun, jun-B, jun-D, zif/268(egr-1, TIS-8, Krox 24, NGF1-A) 등이 있다. 쥐에서 허혈의 상태 즉 국소적인가 전반적인가에 따라 유전자의 발현 부위가 차이가 있다고 Kinouchi 등15)이 발표하였는데 예를들어 국소적 허혈 유발 후 유전자의 발현부위는 허혈 부위에 인접해 발현되며 허혈의 정도가 심하면 발현 부위가 증가한다고 하였다. 본 실험에서는 경미한 일과성 뇌허혈 유발은 뇌세포 손상이 관찰되지 않으나 허혈에 민감한 부위에서는 HSP70의 발현이 증가된 양상을 보였다. Takemoto 등21)의 연구에 의하면 들쥐(Gerbil)에서는 CA3에서 더욱 HSP70의 발현이 증가한다고 보고하였으나 본 실험에서는 CA1에서 특징적으로 증가되었다. 이는 지연성 세포손상이 일어나는 일시적 뇌허혈인 경우와는 달리 본 실험 조작과 같이 지연성 세포손상이 관찰되지 않은 경미하고 일시적인 허혈유발이 원인이라고 생각된다. Takemoto 등21)은 지연성 세포사가 일어난 부위에서는 HSP70의 면역반응에 장애가 일어난다고 하였다. HSP70 유전자에 대한 최근의 연구는 허혈에 대한 치료적 효과 및 가능성에 집중되어 있는데 이는 효과유전자로써 정상쥐의 뇌에서는 발현이 되지 않는 것으로 알려져 있으나, 일부 연구에서는 비록 소량이지만 정상쥐의 뇌에서 발현되는 것으로 Longo 등16)은 보고하였는데 본 실험에서도 정상군에서 일정한 양의 HSP70의 발현이 관찰되어 실험조작의 오류인지, 허혈이 아닌 또 다른 스트레스가 발현에 관여했는지는 좀더 연구할 필요가 있다. HSP70은 기존의 연구에서 밝혀졌듯이 국소적인 또는 전반적인 뇌허혈 유발에서 과발현 되는 것이 관찰되었는데 유도성 HSP70인 HSP72는 허혈에 의한 뇌손상에서 뇌세포 생존 및 회복에 관여하는 것으로 알려져 있으며, HSP70은 ATP-의존 과정을 통해 변성된 세포의 단백질에 부착하여 세포 단백질의 더 이상의 변성을 억제하거나 재생을 촉진하는 작용을 한다. HSP72가 과발현하는 변이종 생쥐에서 허혈 조작에 의한 뇌손상이 정상쥐에 비해 훨씬 적은 것을 확인한 연구 결과에 의해 허혈에 의한 뇌손상 억제에 HSP72의 역할이 관여한다는 보고가 있다.
   Gerbil을 이용한 일시적이고 광범위한 허혈(transient global cerebral ischemia)실험에서 디아제팜을 투여하여 해마의 CA1 지역의 피라밋 세포의 괴사를 줄였으며, 이는 디아제팜이 GABA 신경전달을 증강시킴으로서 나타난다고 보고하였다.11) 그러나 이러한 Gerbil에서 디아제팜의 뇌신경 보호는 저체온증 효과와 동반될 때 한정된다는 연구18)와 디아제팜에 의한 특정부위 세포의 보호 효과에서 저체온증이 반드시 필요한 사항은 아니다19)라는 상반된 연구 결과는 일시적이고 광범위한 허혈(transient global cerebral ischemia)실험에서 디아제팜의 뇌신경 보호 효과 기전이 아직 명확하지 않음을 의미한다. 디아제팜의 뇌허혈 후에 나타나는 보호 효과는 GABA 신경전달을 증강시켜서 허혈 후에 발생하는 지연적인 뇌 손상의 활성화를 억제하는 역할과 디아제팜 투여후 동반되어 발생하는 경도의 저체온증 효과로 인한 기전이 모두 상승작용을 한다고 설명되고 있다.8)

결     론

   신경세포 허혈 사전적응을 위해 경미한 일시적 전뇌허혈을 유발한 백서 모델의 뇌 피질과 해마에서 HSP70의 발현이 증가되었으며 허혈 후 디아제팜이 투여된 백서에서는 HSP70의 발현이 7일째에는 해마와 해마외 뇌조직에서 감소되어 있어 디아제팜이 HSP70의 발현에 영향을 주었음을 알 수 있었다.


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